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浅谈HPLC法测定复方灵芝颗粒中五味子甲素的含量

  目的 建立复方灵芝颗粒中五味子甲素含量测定的方法。方法 用高效液相色谱法测定,色谱条件为C18柱,(5 μm,25×4.6 mm),流动相为甲醇水(体积比75∶25),检测波长为254 nm。结果 五味子甲素在.168~6.432 μg范围内呈现良好的线性关系(R=9996),平均加样回收率为99.27%,RSD=1.2%(n=6)。结论 该法操作简便、准确,重复性好,建立的定量方法可用于复方灵芝颗粒质量的控制。
  关键词HPLC;复方灵芝颗粒;五味子甲素
  Abstract Objiective To establish a method for the content determination of deoxyschizandrin in complex Lingzhi granule. Methods HPLC was performed on an ODS-C18 column (5μm,25 mm×4.6 mm) using methanolwater (75∶25) as the mobile phase under the detection wavelength of 254 nm. Results The linear range of deoxyschizandrin was .168-6.432μg. The mean recovery was 99.27% with RSD 1.2%(n=6).Conclusion This method is simple,reproducible and accurate for the content determination of deoxyschizandrin in complex Lingzhi granule.
  Key wordsHPLC;complex Lingzhi granule;deoxyschizandrin
  复方灵芝颗粒具有保护肝脏降低谷丙转氨酶和退黄作用,用于急性传染性黄疸肝炎,迁延性肝炎,慢性肝炎,单项谷丙转氨酶升高等症,其现行标准收载于中药部颁标准2册,该药由灵芝、柴胡、五味子和郁金4味药材组成,五味子为方中主药之一,为了高及控制复方灵芝颗粒的质量,本文对五味子中的五味子甲素进行含量测定,建立质量标准。本方法简便,准确,重现性好。
  1 仪器和试药
  日本岛津LC-1AT HPLC仪; N2色谱工作站。甲醇(色谱纯,Merck公司出品);双蒸馏水(自制),其他试剂为分析纯。五味子甲素标准对照品购于中国药品生物制品检定所(供含量测定用,批号为11764-217),复方灵芝颗粒(自制,批号2521、2522、2523、 2524)。
  2 方法与结果 1 色谱条件的选择
  色谱柱Inertsil (C18,5 μm,25 mm×4.6 mm);检测波长254 nm;流动相甲醇-水(75∶25),流速1 mL・min-1;进样量1 μL;柱温3 ℃。取一定浓度样品进行测定,此条件下所测五味子甲素与样品中其他组分色谱峰完全分离,色谱峰形对称而尖锐(拖尾因子T=1.),按五味子甲素峰计算,理论板数不小于2。 2 阴性对照试验
  取处方量以相同工艺制备的阴性对照(缺五味子),按上述方法测定,结果为阴性对照色谱图中在与五味子甲素对照品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现,结果表明阴性对照(含灵芝、柴胡和郁金三味药材)用相同制备方法下取的成分在测定波长处无吸收,故其他成分其他对五味子甲素测定无干扰,见图1。 3 样品溶液制备 3.1 对照品溶液的制备
  取五味子甲素对照品15 mg,精密称定,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解后稀释至刻度,摇匀,精密量取1 mL,置1 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度,作为对照品溶液(4.2 μg・mL-1)。
  2.3.2 供试品溶液的制备
  取本品约4 g,研细,精密称定,置1 mL锥形瓶中,加氯仿约4 mL,超声处理3 min,滤过,残渣加氯仿3 mL,超声处理3 min,滤过,合并两次滤液,将容器和滤纸多次洗涤液并入滤液中,挥干,残渣加甲醇溶解并转移置1 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。 4 线性关系考察
  精密吸取五味子甲素对照品贮备液 (.42 mg・mL-1) .5、1.、2.、4.、8. mL,置5 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,分别取上述对照品溶液各1 μL进样,按上述色谱条件测定,以峰面积(A)为纵坐标,进样量(m)为横坐标,进行线性回归,得回归方程A=1 194 733m+59 47,r=.999 6。其线性范围为.42~6.432 μg,结果表明在此范围内呈良好的线性关系。 5 精密度试验
  取上述对照品溶液1 μL,重复进样6次,测定,其RSD=.75%(n=6)。 6 稳定性试验
  取上述对照品溶液1 μL,分别在、2、4、6、8、12 h进样测定,其RSD=.98%(n=6),表明样品在12 h以内是稳定的。 7 重复性试验
  取供试品(批号2521)6份,每份约4 g,按“23”项下方法制备并测定,测出五味子甲素平均含量为15.3 mg・g-1,RSD=1.21%(n=6)。 8 加样回收试验
  取已知含量供试品(批号2521,含量15.3mg・g-1),加入定量的五味子甲素对照品溶液,依样品测定项下的方法测定,计算其回收率=99.27%,RSD=1.2%(n=6),结果见表1。表1 回收率测定结果(略) 9 样品测定
  分别吸取对照品和供试品溶液各1 μL,按上述方法测定供试品中五味子甲素含量,其结果(n=3)为批号2521为15.3 mg・g-1、批号2522为14.2 mg・g-1、批号2523为16.5 mg・g-1和批号2524为13.7 mg・g-1。
  3 讨 论 1 本品由灵芝、五味子等4味药材组成,曾经对灵芝所含腺苷等成分进行测定1,但其含量较低(低于.1%),干扰严重,不宜作为指标成分;结果选用五味子中的五味子甲素作为定量指标,用HPLC法测定其含量,结果阴性无干扰,且方法稳定可靠,专属性强,重复性好。 2 测定时应注意掌握好样品前处理,曾经采用索氏取2,加热回流,超声取对样品进行处理,结果以超声取两次较为完全,操作简单快捷。 3 经过比较不同比例的甲醇水(65∶35)、(75∶25)、(85∶15),乙腈-水-冰醋酸(73.1)3等流动相系统对本品中五味子甲素与杂质的分离度与保留时间,发现流动相甲醇水(75∶25)能保证所测本品与杂峰完全分离(分离度R≥1.5),色谱峰形对称而尖锐(拖尾因子 T=1.)。
  参考文献
  1江英桥.灵芝胶囊质量控制方法研究J.西北药学杂志,21,16(6)112.
  2刘霞,杨远明,蔡敏芝,等. HPLC测定肝平胶囊中五味子甲素含量中成药J.中成药,24,26(7),61.
  3杜英峰,袁志芳,王春英,等. 高效液相色谱法同时测定护肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量J. 药物分析杂志,24,24(4)397.